张霞1 高慧1 阿丽牙·阿布来提1 孜拉来·吐尔洪1 叶喜德1** 叶菁2***
（1 江西中医药大学 南昌330004；2江西中医药大学附属医院 南昌330006）
摘要：目的：探讨江西“建昌帮”姜天麻炮制前后对硝酸甘油诱导大鼠偏头痛作用的影响。方法：选取SD雄性大鼠40只，随机分为空白组、模型组、阳性对照组、姜天麻组、生天麻组，每组8只。皮下注射硝酸甘油制备大鼠偏头痛模型，采用酶联免疫吸附法（ELISA），测定血浆中一氧化氮 (NO)、内皮素 (ET)、降钙素基因相关肽 (CGRP)、脑脊液β-内啡肽 (β-EP)、5-羟色胺(5-HT)和多巴胺 (AD)等含量，对比各组别动物行为学及生化指标情况。结果：与空白组相比，模型组挠头次数明显增多（P＜0.01）；血浆NO、CGRP显著升高（P＜0.01），而ET、β-EP、5-HT均降低（P＜0.01），说明造模成功。与模型组相比，阳性对照组在0~30、30~60min两个时区的挠头次数显著降低（P＜0.01），NO、CGRP含量下降（P＜0.01），ET、β-EP、5-HT含量升高（P＜0.05），AD 升高不具统计学意义（P>0.05）；生天麻与姜天麻组0~30、30~60min两个时区挠头次数显著降低（P＜0.01），ET、β-EP、5-HT均升高（P<0.05），CGRP、NO含量降低（P＜0.05），其中姜天麻组降低较明显；各组别AD含量均升高，但姜天麻组尤为明显（P＜0.01），生天麻组升高不具统计学意义（P>0.05）。结论：天麻对硝酸甘油诱导大鼠偏头痛作用，可能是通过降低NO、CGRP和提高ET、AD、β-EP、5-HT的含量，以达到改善缓解偏头痛症状，且姜天麻较生品作用强，说明炮制后药效增强。本研究可为深入研究天麻提供基础。
关键词：建昌帮；姜天麻；偏头痛；硝酸甘油
天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎。春、冬季采挖，主产于云南、四川、贵州等地。其味甘，性平，入肝经。具息风止痉，平抑肝阳，祛风通络之功[1]。常用治肝阳上亢、肝阳化风之头痛眩晕、手足震颤、肢体麻木、小儿惊风，及风湿痹症、破伤风等，常为偏头痛之要药[2]。历代文献对天麻的炮制虽有记载，但目前仍以《药典》清蒸切薄片为主。天麻采用姜制炮制，可追源到《幼幼集成》[3]，但并无具体的炮制研究内容。
“建昌帮”为江西地方中药炮制主要流派，也是我国南方中药炮制的重要组成部分，在国内外享有极高的声誉，该药帮明确提出姜天麻为其特色饮片[4]。其理论依据是甘平之天麻，经辛温之生姜炮制后，借助“姜制温散”理论，以增强天麻镇静止痛、抗眩晕、止呕等作用。虽然姜制天麻分别在2008年《江西省中药饮片炮制规范》和2011年《广东省中药饮片炮制规范》等版本中有明确记载[5-6]，但只是提出天麻可以姜炙，未有现代研究内容。在缺乏现代研究基础的情况下，使天麻经姜制后发生药效变化机理不清。基于此，课题组成员针对“建昌帮”这一特色饮片，围绕炮制工艺、成分分析和动物行为学等方面开展了姜天麻炮制研究[7-9]。前期基础表明，天麻经姜制后，其化学成分和动物行为等方面发生了变化。说明天麻经姜制后，会对药效产生影响。
本文基于天麻为治偏头痛之要药的角度，探讨炮制前后对该病作用的影响。由于偏头痛病因较多，病机复杂，药物治疗虽然较多[10]。如西药常以西比灵，曲坦类和甲氧氯普胺等[11]，中药常以活血化瘀、行气止痛药为主，如天麻、川芎、桃仁、红花等。相比之下，西药毒副作用相对明显，习惯上人们更倾向于选择中药。然而，截至目前，仍未见有效药物对其进行根治。在对偏头痛的研究方面，主要通过复制偏头痛病理模型，来考察药物对其作用的影响[12]。而制备偏头痛病理模型，常采用的方法，主要是给大鼠头颈部注射硝酸甘油[13]，并在灌胃给药后结合行为学及生化指标，探讨药物对偏头痛作用的影响。可见，这种造模方法业已成熟，也是当前较为理想的选择。
因此，本研究采用硝酸甘油制备大鼠偏头痛病理模型，选取血浆中NO、ET、CGRP和脑组织均匀浆中β-EP、5-HT、AD等生化指标，作为药效评价方法，并结合动物行为学，来探讨天麻姜制前后对偏头痛作用的影响，为深入研究天麻提供数据支撑，也为研发偏头痛新药提供可能。主要研究内容如下：
1 材料
1.1 试验药物及试剂 硝酸甘油注射液 (批号 30190304)，河南润弘制药股份有限公司；正天丸（批号 1888008H），华润三九医药股份有限公司；水合氯醛（批号 20190308），天津市大茂化学试剂厂；氯化钠 (批号 20181008），天津市大茂化学试剂厂；碘伏消毒液 （批号 180411），山东利尔康医疗科技股份有限公司； NO 检测试剂盒 (批号 20190603），南京建成生物工程研究所；大鼠ET检测试剂盒 (批号 20190808)、大鼠CGRP检测试剂盒 (批号 20190716) 、大鼠DA检测试剂盒 (批号 20190808) 、大鼠5-HT检测试剂盒 (批号 20190716) 、大鼠 β-EP 检测试剂盒 (批号 20190716)，购自上海科兴生化试剂公司。
实验用天麻、生姜购于江西省樟树中药材市场，经江西中医药大学教授龚千锋鉴定为天麻合格药材。
1.2 试验动物 选取SPF级SD雄性大鼠，体重（180±20g），购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK（鲁）20190003，饲养以无菌颗粒饲料，自由饮水，鼠房温度24±2℃。
1.3 仪器 DW-86L626 Haier立体式超低温保存箱，海尔特种电器有限公司；KQ5200超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MuLtiskan Go全波长酶标仪，Therm-Fisher；TDL-80-2C低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；TGL-16B离心机，上海安亭科学仪器厂；TissueLyserⅡ匀浆机，凯杰企业管理（上海）有限公司；OSB-2200旋转蒸发仪，厦门精艺兴业科技有限公司；HH-66多功能数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-8000S紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；JB760-68石英比色皿，宜兴市伟鑫仪器有限公司；XK96型快速混匀器，江苏新康医疗器械有限公司。
2 方法
2.1 药液制备 ①姜天麻组，取天麻药材洗净，晾干，用姜榨取汁（天麻：姜汁=100：12.5）闷润至全吸收（15 h），置于电蒸锅中隔水清蒸至透心，取出放凉后，切片，20℃烘干；70％乙醇浸渍法提取，连续提取3次，合并提取液，适当浓缩即可。②生天麻组，依①法制备，得生天麻药物溶液。③阳性对照组，称取12 g，研磨成细粉，置于锥形瓶中，加入96 mL超纯水超声使其充分溶解，即得。
2.2 模型制备 给药半小时后，皮下注射硝酸甘油（10mg•kg-1），复制偏头痛模型。症见大鼠双耳发红、频繁挠头、烦躁不安、爬笼次数增多，最后表现出倦怠、蜷缩等典型的偏头痛特征，即为造模成功。
2.3 分组与给药 取SPF级SD雄性大鼠40只，随机分为5组，每组8只，分别为空白组、模型组、阳性对照组 (1.26 g•kg-1)、姜天麻和天麻组( 1.05 g•kg-1)。适应性饲养7天后，灌胃给药（给药前禁食12 h），每天1次，连续5天。除空白组外，其余各组大鼠在末次给药1 h后[14]，皮下缓慢注射硝酸甘油(10 mg•kg-1)，以诱发偏头痛，空白组皮下注射等量的生理盐水。
2.4 统计分析 实验数据采用 SPSS 23.0 软件处理，均数、标准差采用（`x ± s）表示，组间比较采用独立样本T检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.5 动物行为学考察 皮下注射硝酸甘油后情况：①从模型复制时起，采用持续时间分段记数法，每30 min作为一个时间段，观察造模后大鼠在0～60 min两个时间区段挠头次数。其中绕头出现的时间，以大鼠连续绕头次数达3次以上为准，消失时间以10 min内大鼠挠头次数少于3次并出现倦怠、疲乏为标志。挠头次数抑制率＝(模型组挠头次数－给药组挠头次数)/模型组挠头次数[15]。
2.6 血管中血浆活性物质检测 模型复制4 h后，采用大鼠腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL•kg-1)施行麻醉，腹主动脉取血，置于已加抗凝剂的真空取血管中，离心（3000 r•min-1，4℃，10 min），分离上清液，置-80℃冰箱冷冻保存待测。ELISA法测定ET、CGRP含量，硝酸还原酶法测定NO含量。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。
2.7 脑组织中神经递质检测 大鼠禁食不禁水12 h，腹主动脉取血后，分离出肝门静脉，用冷生理盐水灌流至肝脏转呈为乳白色，于冰上立即剥离脑组织，快速用生理盐水洗掉表面血液，用滤纸吸干[16]，置-80 ℃冰箱存储，备用。
脑组织匀浆制备：精密称定大鼠脑组织0.50 g，放入2 mL EP管，滴加1 mL生理盐水，离心（3000 r•min-1，4℃，10 min），收集上清液，即得脑组织均匀浆，-80℃冷冻备用。严格按试剂盒说明书中的方法，测定β-EP、DA、5-HT含量。
3 结果
3.1 动物行为学考察 如表1显示，与空白组相比，模型组大鼠挠头、爬笼次数明显增多（P＜0.01），造模后的0-60 min区间，大鼠均有不同程度的挠头，其中0-30 min内，以20 min左右挠头最为频繁，30-60 min时挠头次数呈下降之势，但组间差异仍具统计学意义（P＜0.01），说明造模成功。
与模型组比较，各剂量组在0～30 min区间，受试大鼠挠头次数明显减少，组间差异均具明显统计学意义（P＜0.01），阳性对照组、生天麻组和姜天麻组的挠头次数抑制率分别为75.69、19.85、84.08%；在30～60 min区间，大鼠挠头次数虽有减少（P＜0.01），但阳性对照组、生天麻组和姜天麻组的抑制率分别为76.99、34.66、73.47%。
表1 对偏头痛模型大鼠挠头反应的影响 (`x ±s, 次，n = 8)
注：与空白组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
3.2 对大鼠血浆中NO、ET、CGRP和脑组织β-EP、5-HT、AD的影响 如表2、表3显示，与空白组比较，模型组大鼠血浆NO、CGRP著升高，血浆ET和脑组织AD、β-EP、5-HT均降低，各组间差异具明显统计学意义（P＜0.01），说明造模成功。与模型组相比，阳性药组中NO、CGRP降低（P＜0.01）， ET、β-EP、5-HT升高（P＜0.05），AD 虽有升高，但不具统计学意义（P>0.05）；天麻组中NO、CGRP降低，且ET、 β-EP、5-HT 升高，组间差异均具统计学意义（P＜0.05），AD 升高不明显（P>0.05）；姜天麻组中CGRP、NO均明显降低（P＜0.01）， ET、 β-EP、5-HT、AD均明显升高（P＜0.01）；与天麻组对比，除对 β-EP水平影响外，姜天麻组对其他生化指标作用强于天麻组。
表2 对偏头痛大鼠血浆NO、ET、CGRP含量的影响(`x ± s ，n = 8)
注：与空白组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
表3 对偏头痛大鼠脑组织AD、β-EP、5-HT含量的影响 (`x ±s , n = 8)
注：与空白组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
4 讨论
姜天麻为江西“建昌帮”特色中药饮片之一，课题组前期针对“建昌帮”饮片特点，在对其炮制工艺研究的基础上，先后开展了天麻炮制前后成分变化、药性、药效等方面的研究。同时，综述了天麻炮制研究进展。提出了目前对天麻的炮制，多数以《中国药典》采用清蒸切薄片为主，并一直使用至今。涉及辅料对天麻炮制方面的研究，现代文献仍属空白。然后，天麻炮制并未仅仅是清蒸润透后切薄片为主，辅料对其炮制早已有文献记载。如《雷公炮炙论》之蒺藜子制法，酒制见于《颅囟经》、《素问病机气宜保命集》、《卫生宝鉴》和《丹溪心法》等。这些辅料制法，主要是基于经验，并未对天麻炮制变化机理具体内容进行描述。现有2015年版本的《中国药典》，采用以润软切片和蒸制为主，并一直沿用至今。对辅料炮制研究较少，很少涉及姜制法。建昌帮为江西地方特色炮制流派，也是我国主要炮制流派，其提出的姜制天麻，主要是基于天麻性能和所致病证。由于天麻为治偏头痛之常用要药，生姜为辛温之品，常用治外感风寒引发的头痛，天麻拟借助生姜之温散之性，以增强其止痛之效，但这种作用变化机理仍停留于地方用药经验，目前未见其炮制作用研究。可见，姜制天麻虽为建昌帮特色饮片，在缺乏现代研究基础的情况下，在临床应用中推广受限。
现有文献虽然对偏头痛的研究较多，但偏头痛病机复杂，难于找到有效药物对其进行根治。显然，西药由于毒副作用明显，对其治疗存在很大局限性。中药虽多靶点，但毒副作用相对较低，也易于人们接受。中药在临床应用前，必须进行炮制。江西“建昌帮”提出的“姜制天麻”，明确说明姜制可以缓解用治偏头痛作用，这为治疗偏头痛寻找新的药物来源提供契机。现有文献对偏头痛的机制研究，主要有神经源学说、血管源学说、三叉神经血管源学说等，另有《灵枢•厥病篇》记载“头为诸阳之会，唯风邪可至”，表明偏头痛病因病机可分为气虚血瘀、综合风邪[18]等。基于此，人们相继建立了离体偏头痛模型，如三叉神经离体培养模型、离体血管模型；在体实验模型，如在体血管模型、三叉神经节刺激模型、硬脑膜刺激模型、皮层刺激模型、硝酸甘油模型、5-HT耗竭模型、基因工程鼠模型、原发性头痛大鼠模型等多种偏头痛模型[19]。
偏头痛生理病理学机制主要是皮层扩展性抑制，诱导发生后引起相关的偏头痛活性物质，如NO、CGRP释放导致偏头痛症状[20]。本研究所制备的硝酸甘油病理模型，其引起偏头痛的作用机制，与其机理相似，也是目前最为常用的偏头痛病理模型。由于硝酸甘油是一种血管扩张剂，它可以通过释放血管壁中的NO而诱导血管松弛[21]，并借助硝酸甘油亲酯性强、易通过血脑屏障等特点，使机体释放大量NO，致使脑血管进一步扩张，造成血中5-HT水平降低，从而诱发实验性偏头痛[22]。
硝酸甘油复制模型成功后会在1 h内出现明显的挠头、耳红、爬笼现象，本实验选择以1 h内大鼠挠头作为行为学评价指标。实验观察得到，造模2 min左右即可观察到爬笼、挠头等偏头痛症状，与模型组相比，0～60 min天麻姜制前后均对硝酸甘油诱导偏头痛的挠头有干预作用，其中20 min左右为其挠头行为的高发期，天麻与姜天麻对硝酸甘油诱导大鼠偏头痛行为学均有抑制作用，并且姜制过后的天麻效果更优。
从生化指标来说，考察偏头痛常用指标有NO、β-EP、CGRP、ET、DA、5-HT等[23-24]。由于5-HT是偏头痛发作中的关键介质[25]，脑循环中最强烈的血管收缩胺，在偏头痛发作前期，血小板释放5-HT，使5-HT水平增加，引起脑血管收缩，即为偏头痛先兆症状。然而在头痛发作期间，水平升高的5-HT 又转而被单胺氧化酶A 不断分解，致使5-HT 水平逐渐降低，血管收缩难于维持，引起头皮血管扩张，导致头痛[26]。
CGRP主要是负责拮抗阿片肽在内源性疼痛调节系统中的镇痛作用，常与神经肽Y(NPY)、硬脑膜中白细胞介素-1β和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)两种炎症因子及蛋白激酶磷酸化等多种因素相互影响[27]，诱发偏头痛。在偏头痛发作期间，内源性疼痛调节系统中CGRP表达可能增加，以拮抗内源性阿片肽的镇痛作用而诱导持续的偏头痛[28]。可见，CGRP含量升高，可作为考察偏头痛的重要指标。ET是人体最强的血管收缩因子[29]，是脑内重要的神经肽介导物质，其主要生理功能是调剂心血管功能，维持血管张力及血管系统稳态。ET含量异常，是偏头痛发作的重要介导机制之一。β-EP是内源性阿片肽结合受体，具有较强的中枢镇痛作用，可结合痛觉神经系统中阿片受体，而抑制初级感觉神经元途径脊髓、三叉神经之间的痛神经传导，以产生镇痛作用。因此，脑脊液β-EP的水平与偏头痛的发展呈正相关[30-31]。DA 是机体一种重要的儿茶酚胺类神经递质，可兴奋三叉神经系统中DA受体，使三叉颈复合体神经元难于激活，以阻断痛感神经信号通路的传导，而减轻疼痛作用。研究发现，DA超敏现象常存于偏头痛患者当中[32-33]。因此，通过检测DA含量，可作为判断药物对偏头痛影响的重要因素。
本研究通过综合分析偏头痛发病机制，结合姜制天麻炮制前后药物性能，对由硝酸甘油诱导大鼠偏头痛的进行了研究。主要从动物行为学和细胞层面进行了考察。结合本研究结果，灌胃给药后，与空白组相比，模型组挠头次数明显增多（P＜0.01），说明姜制对天麻的炮制作用，对受试大鼠行为产生影响。针对生化指标检测情况，本研究得到，与模型组相比，阳性组0~30、30~60min两个时间段的挠头次数显著降低（P＜0.01），NO、CGRP降低（P＜0.01），ET、β-EP，5-HT升高（P＜0.05），AD 虽有升高，但不具统计学意义（P>0.05）；天麻与姜天麻组0~30、30~60min两个时间段挠头次数显著降低（P＜0.01），ET、β-EP、5-HT均升高（P<0.05）；CGRP、NO均明显降低（P＜0.05），其中姜天麻组降低更为明显；AD含量均升高，但姜天麻组尤为明显（P＜0.01），天麻组虽有升高，但组间差异不具统计学意义（P>0.05）。
综上所述，通过测定偏头痛大鼠血浆中CGRP、ET、NO和脑组织均匀浆AD、β-EP、5-HT等含量，可推断炮制后的天麻对硝酸甘油诱导大鼠偏头痛可能的作用机制。主要是通过降低NO、CGRP活性，提高ET、AD、β-EP、5-HT水平，表明姜天麻有较强的血管收缩及痛域增强作用，能调节机体神经传递，改善血管微循环缓解偏头痛症状，发挥对偏头痛的治疗作用，显然，天麻经姜制后，增强了镇痛作用。然而，由于天麻所含成分较多，且不同极性部位药效存在差异。虽然天麻经姜制后可提高其对偏头痛的作用，但发挥这种作用的效应成分仍有待研究，希望本文为揭示天麻炮制作用机理提供数据支撑。
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（本文刊于《中药新药与临床药理》2020年第8期）
